Mutacje w genie dejodynazy nukleotydowej i niedoczynności tarczycy ad

Badania genetyczne przeprowadzono po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody od pacjentów lub ich rodziców. Screening for Mutations
Sześć kodujących egzonów DEHAL1 (numer dostępowy National Center for Biotechnology Information, AY259176.1) zamplifikowano za pomocą testu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z genomowego DNA z użyciem starterów flankujących połączenia intron-ekson. (Sekwencje starterów są wymienione w Dodatkowym Dodatku, dostępnym wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org). Produkty PCR zostały oczyszczone przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR (Roche) i zostały bezpośrednio zsekwencjonowane za pomocą zestaw do sekwencjonowania cyklu BigDye Terminator V1.1 i automatyczny sekwenser ABI 3100 (PerkinElmer).
Analiza funkcjonalna mutantów
Uzupełniające DNA dzikiego typu DEHAL1 subklonowano w wektorze ekspresyjnym pcDNA3.1 i następnie poddano ukierunkowanej mutagenezie (Stratagene) dla trzech zmian zidentyfikowanych u pacjentów. Zmutowane allele typu dzikiego uległy ekspresji w komórkach ssaczych, które zostały zhomogenizowane i poddane testowi dejodynazy jododyrozyny dla substratów monojodotyrozyny i dijodotyrozyny za pomocą chromatografii kationowymiennej.
Aby przetestować reakcję mutantów na mononukleotyd flawiny, zwiększone stężenia flawiny dodano pożywki do hodowli komórkowej po transfekcji, a homogenaty analizowano pod względem zdolności do deemi-nacji monojodotyrozyną po 24 godzinach. Stabilność białek mutantów badano przez kwantyfikację sygnałów białkowych w blotach Western z użyciem przeciwciał poliklonalnego peptydu przeciwko DEHAL1 (Eurogentec). Aby zbadać wpływ zidentyfikowanych lokalnych zmian aminokwasów, wytworzono różne sztuczne mutanty w pozycjach aminokwasów, które wykazywały mutacje u pacjentów i były testowane funkcjonalnie w teście z dejodynazą jododyrozynową. (Dalsze szczegóły dotyczące procedur eksperymentalnych znajdują się w sekcji Metody dodatku dodatkowego).
Wyniki
Fenotypy pacjentów
Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka pacjentów. Pacjentka 1, 26-letnia kobieta, która urodziła się w Niemczech w stosunku do spokrewnionych rodziców pochodzenia tureckiego, miała normalny poziom tyreotropiny podczas przesiewowych badań noworodkowych.15 Jednak w wieku 18 miesięcy przedstawiła typowe objawy niedoczynności tarczycy, w tym powiększony język, spuchnięta i sucha skóra i gruby płacz. Miała niski wzrost (<3 centyla w swoim wieku) i opóźniony wiek kostny o 9 miesięcy. W skali rozwojowej Denver dla niemowląt miała opóźnienie od 6 do 8 miesięcy. Testy czynności tarczycy były zgodne z głęboką pierwotną niedoczynnością tarczycy, a powiększony gruczoł tarczowy był widoczny klinicznie i na ultrasonografii (Tabela 1). Wychwyt tarczycy z jodu-123 był szybki i wysoki, a podawanie nadchloranu nie uwolniło radiojodu z gruczołu, co wykluczyło istnienie defektu jodkowego. Poziom diiodotyrozyny w surowicy był podwyższony. Pomimo natychmiastowego leczenia i ścisłej kontroli hormonalnej w okresie dzieciństwa, pacjent miał opóźnienie psychoruchowe, z niskim IQ (85 w wieku 9 lat) i słabymi wynikami w szkole. Jej rodzice byli eutyreozą i bez wole.
Pacjenci 2 i 3, odpowiednio, w wieku 47 i 43 lat, byli siostrami, u których rozpoznano niedoczynność tarczycy w okresie niemowlęcym i urodziły się przed erą rutynowych badań przesiewowych w kierunku wrodzonej niedoczynności tarczycy (Tabela 1)
[hasła pokrewne: leczenie endometriozy, objawy endometriozy, oprogramowanie stomatologiczne ]

Powiązane tematy z artykułem: leczenie endometriozy objawy endometriozy oprogramowanie stomatologiczne